На протяжении всего слешера от третьего лица мы встретимся с четой Медичи, узнаем больше подробностей о Леонардо Да Винчи и Никколо Макиавелли. В то же время нашими врагами будут Борджиа, Франческо Пацци и Джироламо Савонарола. Продолжение истории Дезмонда Майлза, который попался в руки современного аналога Тамплиеров, проходит в эпоху Возрождения с 1476 по 1499 года.
Среди двух организаций ведется ожесточенная интеллектуальная битва. Объект 16 похищает Дезмонда, чтобы тот научился лучше владеть своими предками и стал настоящим ассасином, в то время как Тамплиеры хотели лишь завладеть информацией о Частицах Эдема.
События игры разворачиваются на почве кровной мести за отца и братьев. Когда Эцио был ребенком, он лишился отца и братьев, потому что так захотел Пацци — главный антагонист игры. Убив практически всю семью Пацци, Эцио узнает, что следующие действия Тамплиеров будут проходить в Венеции, где они намерены вершить власть и искать Частицы Эдема. Разработчики добавили для игрока несколько нововведений. Например, теперь ассасин может нырять в воду и плавать там до того, пока не кончится здоровье. Также мы можем выхватывать оружие из рук противника. Слешер сильно изменился в плане боя, поэтому количество комбинаций потерпело изменение.
